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RNA病毒編碼的依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，簡稱RdRP）是一類獨特的核酸聚合酶，在病毒基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮核心作用，是抗病毒藥物研究的熱點靶標。病毒的RdRP由于可與其他功能域融合或與其他病毒蛋白共折疊，其整體結(jié)構(gòu)多樣性較高，但其催化核心區(qū)的三維結(jié)構(gòu)則較為保守，因此RdRP兼具多樣性和保守性。由于RNA病毒的宿主范圍幾乎囊括了所有細胞形式的生命體，在與不同宿主的共同進化過程中，RdRP作為RNA病毒最保守的蛋白，其與病毒的宿主適應(yīng)性之間的關(guān)聯(lián)并不清晰。
黃病毒包括乙型腦炎病毒（Japanese encephalitis virus，簡稱JEV）、登革病毒（dengue virus，簡稱DENV）、寨卡病毒、蜱傳腦炎病毒（tick-borne encephalitis virus，簡稱TBEV）等多種人類致病病原，是一類分布廣泛、種類繁多的單股正鏈RNA病毒，與丙型肝炎病毒和經(jīng)典豬瘟病毒同屬于黃病毒科。黃病毒大多由吸血節(jié)肢動物如蚊和蜱作為媒介傳播，可引起人類腦炎或出血性疾病，對人類健康構(gòu)成重大威脅。黃病毒的RdRP位于病毒編碼的非結(jié)構(gòu)蛋白NS5的羧基端，與氨基端的甲基轉(zhuǎn)移酶（MTase）形成天然融合體。此前蚊傳黃病毒的NS5已有多個三維結(jié)構(gòu)報道，包括全長蛋白、MTase區(qū)和RdRP區(qū)的結(jié)構(gòu)，而蜱傳黃病毒NS5蛋白的全長結(jié)構(gòu)及RdRP三維結(jié)構(gòu)則未獲解析。
中國科學(xué)院武漢病毒研究所龔鵬研究員團隊長期從事病毒RdRP的催化與調(diào)控機制研究，該團隊此前分別解析了JEV和DENV的NS5全長蛋白晶體結(jié)構(gòu)（Lu and Gong, PLoS Pathog 2013; Wu et al., PLoS Pathog 2020），并與武漢病毒所張波研究員團隊合作，系統(tǒng)性揭示了NS5的構(gòu)象多樣性和保守性以及MTase調(diào)控RdRP的分子機制（Li et al. PLoS Negl Trop Dis 2014; Wu, et al. J Virol 2015; Wu et al., PLoS Pathog 2020）。該團隊近期解析了分辨率為1.9 埃的TBEV MTase晶體結(jié)構(gòu)（PDB號7D6M，圖1A）和分辨率為3.2埃的TBEV RdRP的晶體結(jié)構(gòu)（PDB號7D6N，圖1B），獲得了首個蜱傳黃病毒RdRP的三維結(jié)構(gòu)信息。通過黃病毒RdRP的序列分析以及與結(jié)構(gòu)已知的蚊傳黃病毒RdRP的結(jié)構(gòu)進行比較，發(fā)現(xiàn)在RdRP保守的催化基序（motif ）B和C之間存在一個值得關(guān)注的區(qū)域（以下稱B-C連接區(qū)）。該區(qū)域位于RdRP手掌區(qū)的底部且暴露于蛋白表面，且在黃病毒屬的不同宿主分類中具有明顯的宿主相關(guān)多樣性（圖1B及圖2）。
該團隊設(shè)計了TBEV和JEV病毒間B-C連接區(qū)的替換突變，在酶學(xué)水平證實突變對RdRP催化功能不構(gòu)成本質(zhì)影響（圖3，A-B）。團隊通過與武漢病毒所王漢中研究員/鄭振華研究員團隊和張波研究員團隊合作，在細胞水平分別評測了突變對TBEV和JEV的影響，結(jié)果表明在兩種病毒體系中突變后的病毒不能維持在細胞中的增殖（圖3，C-D）。這些結(jié)果提示B-C連接區(qū)很可能參與了RdRP催化以外與病毒增殖相關(guān)的重要過程。通過對正鏈、負鏈和雙鏈RNA病毒中的代表性RdRP的B-C連接區(qū)進行結(jié)構(gòu)與序列的系統(tǒng)分析，在RNA病毒大家族中進一步發(fā)現(xiàn)該區(qū)域在結(jié)構(gòu)和序列長度方面具有較高的多樣性（圖4），提示RdRP的B-C連接區(qū)很可能是RNA病毒共有的一個宿主適應(yīng)熱點區(qū)域，此項研究為病毒RdRP的調(diào)控機制研究及RdRP相關(guān)的宿主適應(yīng)研究提供了重要線索。
此項研究主要受到國家重點研發(fā)計劃項目“畜禽重要病原共感染與協(xié)同致病機制研究”（2018YFD0500100，項目負責(zé)人為中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院上海獸醫(yī)研究所丁鏟研究員）和NSFC面上項目（31670154; 32070185）的支持。博士研究生楊婕妤和博士后景旭平為論文的共同第一作者，主要完成了結(jié)構(gòu)與酶學(xué)研究工作，龔鵬、鄭振華和張波為共同通訊作者，王漢中/鄭振華團隊的實驗師易文富、碩士研究生姚琛和張波團隊的博士后李曉丹分別完成了TBEV和JEV病毒學(xué)研究工作，相關(guān)論文近期于Nucleic Acids Research（《核酸研究》）上在線發(fā)表，原文鏈接為： https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkaa1250/6066638?guestAccessKey=c6d13ee0-287e-4d7b-97dc-01d9456423e7
圖1. TBEV MTase和RdRP的晶體結(jié)構(gòu)。A）MTase結(jié)構(gòu)中結(jié)合了一個甲基供體SAM分子。B）RdRP由拇指、手指和手掌三個結(jié)構(gòu)域組成，B-C連接區(qū)（淺粉色）位于手掌區(qū)底部。
圖2. 黃病毒科RdRPs中B-C連接區(qū)結(jié)構(gòu)和序列的多樣性。A）第一排中TBEV屬于蜱傳黃病毒，其余屬于蚊傳黃病毒。第二排中TBEV和JEV屬于黃病毒屬，而HCV和CSFV分別屬于黃病毒科中的肝炎病毒屬和瘟病毒屬。其中motif B、B-C連接區(qū)和motif C分別用黃色、橙色和淺綠色表示。B）黃病毒NS5中B-C區(qū)域的序列比對。根據(jù)宿主的不同，黃病毒可以分為蚊傳、蜱傳、僅在昆蟲中傳播和僅在脊椎動物中傳播四類。
圖3. 病毒種間B-C連接區(qū)替換突變影響病毒增殖。A-B）將連接區(qū)替換為JEV序列的TBEV NS5表現(xiàn)出與野生型聚合酶相似的依賴引物（A）和從頭合成（B）活性。C-D）在細胞水平上TBEV和JEV的連接區(qū)替換突變體均不能實現(xiàn)病毒增殖。
圖4. 病毒RdRP的B-C連接區(qū)展現(xiàn)出較高的多樣性。上中下三行分別為正鏈、負鏈和雙鏈RNA病毒代表性RdRP的連接區(qū)結(jié)構(gòu)。每個彩色結(jié)構(gòu)分別代表一個RNA病毒科。其中B-C連接區(qū)用橙色顯示。左側(cè)為多結(jié)構(gòu)疊印圖（灰色）。