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近日，武漢病毒所/華中科技大學(xué)/南開大學(xué)聯(lián)合團(tuán)隊在布尼亞病毒核酸內(nèi)切酶的催化機制，以及基于結(jié)構(gòu)的藥物干預(yù)機制研究中取得重要進(jìn)展。兩篇相關(guān)研究成果“Insights into two-mietal-ion catalytic mechanism of cap-snatching endonuclease of Ebinur Lake virus in Bunyavirales”，以及 “Structural and biochemical basis for development of diketo acid inhibitors targeting the cap snatching endonuclease of the Ebinur Lake virus (order: Bunyavirales)”相繼在線發(fā)表在Journal of Virology上。
布尼亞病毒包含許多重要的人和動物病原，對公共健康和農(nóng)牧業(yè)構(gòu)成了嚴(yán)重威脅，目前尚未有針對該類病毒的疫苗和特異性治療藥物。艾比湖病毒（Ebinur Lake virus，EBIV）是近年在我國新疆艾比湖地區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種新型蚊媒布尼亞病毒，前期研究結(jié)果表明EBIV對我國人口健康構(gòu)成潛在生物安全風(fēng)險。包括布尼亞病毒和流感病毒在內(nèi)的分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒普遍利用一種獨特的“奪帽”機制來起始病毒的轉(zhuǎn)錄。奪帽過程由病毒編碼的L蛋白執(zhí)行，該蛋白中段為依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase，RdRP），N端區(qū)域包含核酸內(nèi)切酶（endonuclease，EN）結(jié)構(gòu)域，C端區(qū)域包含帽子結(jié)合域（cap binding domain，CBD），在CBD的協(xié)同作用下，由EN實現(xiàn)宿主mRNA的切割。由于切割得到的含5'帽子結(jié)構(gòu)的寡核苷酸被用作RdRP轉(zhuǎn)錄的引物，因此EN可作為重要的病毒干預(yù)靶點。
研究團(tuán)隊首先解析了一系列高分辨率（2.0-2.6埃）的EBIV EN野生型和活性位點突變體晶體結(jié)構(gòu)，并結(jié)合體外核酸內(nèi)切酶生化實驗，深入分析了EN活性位點結(jié)構(gòu)與功能之間的關(guān)系。研究結(jié)果顯示，EBIV EN是一種二價金屬離子依賴的RNA核酸內(nèi)切酶，能特異性切割富含尿嘧啶且不含二級結(jié)構(gòu)的單鏈RNA，其酶活嚴(yán)格依賴活性位點兩個金屬離子的結(jié)合（圖1）。EBIV EN野生型和突變體蛋白的晶體結(jié)構(gòu)分析進(jìn)一步支持雙金屬離子催化機制，且兩個金屬離子在活性位點上的結(jié)合具有相關(guān)性。該研究為深入理解分節(jié)段負(fù)鏈 RNA 病毒核酸內(nèi)切酶的工作機制提供了重要證據(jù)。
圖1. EBIV EN的活性依賴于活性位點兩個二價金屬離子的結(jié)合。（A）EBIV EN活性位點區(qū)域的立體對象圖。（B）EBIV EN 野生型和活性位點突變體的核酸內(nèi)切酶活性分析。
在此基礎(chǔ)上，研究團(tuán)隊進(jìn)一步對EBIV EN的干預(yù)機制進(jìn)行了研究。研究團(tuán)隊首先以EN金屬螯合型抑制劑二酮酸類化合物L(fēng)-742,001為原型，設(shè)計和合成了一系列衍生化合物，隨后結(jié)合酶學(xué)，病毒學(xué)和晶體學(xué)方法對這些化合物的構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了深入探究。研究結(jié)果表明，L-742,001及其9種衍生物能以不同程度抑制EBIV EN的體外酶活和細(xì)胞水平上的病毒復(fù)制。EN與抑制劑復(fù)合物晶體結(jié)構(gòu)分析（圖2）進(jìn)一步顯示，L-742,001的二酮酯基團(tuán)通過金屬螯合作用占據(jù)EN的活性中心，對氯苯基團(tuán)則與活性位點殘基形成穩(wěn)定的疏水堆積作用，二者對其活性至關(guān)重要；其苯基由于結(jié)構(gòu)上的靈活性和結(jié)合口袋的開放性，可以采用多種構(gòu)象與活性位點相互作用，因此是最具優(yōu)化潛力的基團(tuán)。該研究揭示了L-742,001二酮酸類化合物干預(yù) EN 的分子機制，為靶向分節(jié)段負(fù)鏈RNA病毒EN的廣譜抑制劑設(shè)計和優(yōu)化提供了重要的科學(xué)依據(jù)。
圖2. L-742,001及其衍生物IN5, IN16與EBIV EN的結(jié)合模式。EBIV EN活性位點參與抑制劑結(jié)合的關(guān)鍵氨基酸以白色棍狀模型顯示，L-742,001及其衍生物以黃色棍狀模型顯示，錳離子以青色球體顯示。
華中科技大學(xué)同濟醫(yī)學(xué)院法醫(yī)學(xué)系博士后匡文華為兩篇論文的第一作者；武漢病毒所龔鵬研究員/華中科技大學(xué)的周亦武教授、武漢病毒所胡志紅研究員/南開大學(xué)郭宇教授，分別為兩篇論文的共同通訊作者。研究得到了國家重點研發(fā)計劃（2018YFA0507200，2018YFA0507203）、中國科學(xué)院武漢國家生物安全實驗室高端用戶培育項目（2021ACCP-MS10，2020-NBL-ZD-00030，2018ACCP-ZD02），病毒學(xué)國家重點實驗室開放研究基金項目（2020IOV003），中國博士后科學(xué)基金（2018M632827），湖北江夏實驗室生物安全科技重點項目（JXBS001）和湖北省自然科學(xué)基金杰青項目（2021CFA050）等經(jīng)費的支持。
文章鏈接：
1. https://doi.org/10.1128/jvi.02085-21
2. https://doi.org/10.1128/jvi.02173-21