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RNA病毒包括多種致病病原，對人類健康構(gòu)成嚴重威脅。RNA病毒的基因組復(fù)制和轉(zhuǎn)錄過程需要自身編碼的依賴RNA的RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase， RdRP）來主導(dǎo)完成，該過程經(jīng)歷引發(fā)（initiation）、延伸（elongation）和終止（termination）階段，由數(shù)以千計的核苷酸添加循環(huán)（nucleotide addition cycle，NAC）組成。該循環(huán)的機制不僅是了解RNA病毒本質(zhì)特征的重要內(nèi)容，也是發(fā)展針對RdRP的抗病毒策略的重要依據(jù)。關(guān)于病毒RdRP的現(xiàn)有研究表明，每個NAC經(jīng)歷四個步驟：1. 反應(yīng)底物NTP進入RdRP活性中心；2. RdRP活性中心關(guān)閉（active site closure）；3. 核苷酸轉(zhuǎn)移（nucleotidyl transfer）反應(yīng)發(fā)生（產(chǎn)物RNA的3’-末端添加一個核苷酸）；4. RdRP向下一位模板核苷酸轉(zhuǎn)位（translocation）從而開啟下一輪循環(huán)。過去十余年間，結(jié)構(gòu)生物學(xué)與酶學(xué)研究已基本完整勾勒出該NAC的機制，但始終未能準(zhǔn)確獲得催化反應(yīng)（步驟3）即將發(fā)生時的RdRP結(jié)構(gòu)信息，因此對于哪些氨基酸殘基在催化反應(yīng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用仍存在爭議。
中國科學(xué)院武漢病毒研究所龔鵬研究員團隊長期從事病毒RdRP催化機制研究，近期該團隊通過在腸道病毒71型（enterovirus 71，EV71）RdRP-RNA復(fù)合物晶體浸泡實驗中的多方嘗試，成功解析了高度接近催化反應(yīng)發(fā)生狀態(tài)的RdRP晶體結(jié)構(gòu)（圖A，PDB編號：7W9S，分辨率2.5埃），發(fā)現(xiàn)位于RdRP基序D附近的一個賴氨酸殘基K360與結(jié)構(gòu)中底物CTP的g-磷酸存在近距離相互作用（3.3埃）。在與EV71同為腸道病毒的脊髓灰質(zhì)炎病毒的前期研究中，等同的K359殘基被認為直接參與了催化反應(yīng)和其中的質(zhì)子轉(zhuǎn)移過程，而上述晶體結(jié)構(gòu)中觀測到的近距離相互作用進一步提示了這種可能性。據(jù)此，該團隊選取了EV71 RdRP的K360殘基和另一個與CTP的磷酸基團存在相互作用的基序F精氨酸殘基R174為突變位點設(shè)計了系列突變體，利用酶學(xué)方法對野生型RdRP和突變體的單步延伸速率常數(shù)和CTP米氏常數(shù)（圖B）、RdRP延伸狀態(tài)（elongation）和延伸前狀態(tài)（pre-elongation）下催化的pH依賴性等多種參數(shù)和性質(zhì)進行了表征。結(jié)果表明，K360位點的突變不僅降低了催化效率而且在延伸和延伸前狀態(tài)下都能影響RdRP的pH依賴特性，而R174位點的突變所造成的影響與K360類似且能額外降低底物CTP的親和力。這些數(shù)據(jù)表明K360和R174都直接參與催化反應(yīng)，但這兩個殘基是否直接參與質(zhì)子轉(zhuǎn)移仍有待進一步取證。這項工作是該團隊繼解析RdRP活性中心部分關(guān)閉結(jié)構(gòu)（對應(yīng)NAC步驟2）和揭示不對稱轉(zhuǎn)位現(xiàn)象（對應(yīng)NAC步驟4）（PNAS 2016；Nature Communications 2020）等NAC系列工作后的又一項成果（對應(yīng)NAC步驟3），闡明了該循環(huán)的全過程機制（圖C和動圖）。
相關(guān)論文近期在線發(fā)表于Nucleic Acids Research（《核酸研究》），此項研究受到國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFA0507200，項目負責(zé)人為陳新文研究員）、國家自然科學(xué)基金項目（32070185）、湖北省江夏實驗室生物安全科技重大項目（JXBS001）等的支持。武漢病毒所博士研究生/博士后李瑞（2021年獲得博士學(xué)位，主要完成酶學(xué)研究）和博士研究生王美華（2021年獲得博士學(xué)位，主要完成結(jié)構(gòu)生物學(xué)研究）為論文的共同第一作者，龔鵬研究員為論文的通訊作者。
論文及前續(xù)系列論文鏈接為：
https://academic.oup.com/nar/advance-article/doi/10.1093/nar/gkac1133/6882138
https://www.nature.com/articles/s41467-020-16234-4
https://www.pnas.org/doi/epdf/10.1073/pnas.1602591113
病毒RdRP完整NAC動圖
圖：病毒RdRP核苷酸添加循環(huán)新機制。A）接近催化反應(yīng)發(fā)生狀態(tài)的EV71 RdRP晶體結(jié)構(gòu)立體對像圖。B）K360和R174位點的突變大幅降低RdRP催化效率。C）病毒RdRP核苷酸添加循環(huán)（NAC）的完整結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，圖中參考狀態(tài)1-4之間的轉(zhuǎn)換過程1-2、2-3、3-4和4-1分別對應(yīng)NAC步驟1、2、3和4。A和C中的RdRP基序用白色大寫字母標(biāo)注。