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工作動(dòng)態(tài)
武漢病毒所基于HSV-1 H129株擴(kuò)增子開(kāi)發(fā)了新型快速、高效順向跨單級(jí)示蹤系統(tǒng)H129Amp
2022年12月，國(guó)際學(xué)術(shù)期刊《Nature Communications》在線發(fā)表了中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所羅敏華團(tuán)隊(duì)的最新成果，論文題目為“An HSV-1-H129 amplicon tracer system for rapid and efficient monosynaptic anterograde neural circuit tracing”。該研究基于HSV-1 H129擴(kuò)增子與H129-dTK-T2進(jìn)行多輪病毒改造，研發(fā)出標(biāo)記亮度高、實(shí)驗(yàn)周期短（5天）、操作簡(jiǎn)單（1次病毒注射）、標(biāo)記的下游神經(jīng)元毒性低的新型順向跨單級(jí)示蹤工具系統(tǒng)H129Amp。
繪制腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)結(jié)圖譜對(duì)解析大腦結(jié)構(gòu)與功能不可或缺。神經(jīng)環(huán)路示蹤病毒工具是解析腦聯(lián)結(jié)圖譜的重要工具。羅敏華課題組首先對(duì)HSV-1 H129株進(jìn)行改造，開(kāi)發(fā)了攜帶2x GFP和2x mGFP的高亮度的順向跨多級(jí)示蹤工具H129-G4。H129-G4熒光強(qiáng)度高，可展示神經(jīng)元樹(shù)突棘等細(xì)節(jié)，為首個(gè)與fMOST聯(lián)用的順向示蹤工具。在該病毒改造平臺(tái)基礎(chǔ)上，團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)并首次報(bào)道了順向跨單級(jí)示蹤工具H129-dTK-tdT（Mol Neurodegener. 2017. 12:38），填補(bǔ)了順向跨單級(jí)示蹤工具的空白，實(shí)現(xiàn)了0到1的突破。團(tuán)隊(duì)隨后研發(fā)了H129-dTK-T2，提高標(biāo)記亮度，優(yōu)化了生產(chǎn)和應(yīng)用工藝 (Neurosci Bull. 2020.37:701)。為增強(qiáng)順向跨單級(jí)示蹤工具的標(biāo)記強(qiáng)度和效率、縮短示蹤時(shí)間、并降低其末端吸收，該團(tuán)隊(duì)靶向H129的gK基因，構(gòu)建突變gK囊膜化的順向跨單級(jí)示蹤工具H129-dgK-G4。H129-dgK-G4展示了更高標(biāo)記強(qiáng)度和示蹤效率、更特異的順向標(biāo)記特性、縮短了示蹤時(shí)間（Mol Neurodegener. 2022. 17:6）。
該團(tuán)隊(duì)進(jìn)一步采取全新策略，以H129-dTK-T2-pacFlox作為輔助病毒，H129擴(kuò)增子作為示蹤病毒，構(gòu)建了H129Amp示蹤系統(tǒng)。示蹤病毒H129Amp含多拷貝串聯(lián)的標(biāo)記基因（靶基因），可快速、高效表達(dá)靶標(biāo)蛋白，標(biāo)記下游神經(jīng)元；傳播到下游神經(jīng)元的H129Amp示蹤病毒，不含任何病毒毒性基因，對(duì)下游神經(jīng)元無(wú)/低毒性。除基因組不同外，輔助病毒與示蹤病毒結(jié)構(gòu)和感染特性一致，可混合后同時(shí)注射（單次），5天后可高亮標(biāo)記下游神經(jīng)元，結(jié)合光遺傳學(xué)工具AAV-DIO-ChR2或H129-dgK-G4順向跨單級(jí)示蹤工具系統(tǒng)，可進(jìn)行功能性研究或順向跨兩級(jí)示蹤。與傳統(tǒng)示蹤工具相比，其優(yōu)勢(shì)包括 1）該系統(tǒng)具有標(biāo)記亮度高，不需要免疫染色以放大信號(hào)；2）實(shí)驗(yàn)周期短， 由30天縮短至5天，大大縮短了實(shí)驗(yàn)周期；3） 操作簡(jiǎn)單和避免空間錯(cuò)位，單次病毒注射替代了原來(lái)的2次序貫性（第1、21天）病毒注射，簡(jiǎn)化了操作，避免了2次注射導(dǎo)致的空間錯(cuò)位，重復(fù)性和標(biāo)記效率高；4）下游神經(jīng)元無(wú)/低毒性，可進(jìn)行功能研究、順向跨兩級(jí)研究等。有望進(jìn)一步推動(dòng)神經(jīng)科學(xué)和腦計(jì)劃。
該研究得到了國(guó)家自然科學(xué)基金（81620108021, 82172264, 32070169, 81571355, 81601206）的資助。武漢病毒所博士生熊鋒（現(xiàn)中科院精密測(cè)量科學(xué)和技術(shù)創(chuàng)新研究院博士后）和楊虹為共同第一作者，武漢病毒所羅敏華研究員、曾文波副研究員、北京腦科學(xué)與類腦研究中心載體中心主任趙非為共同通訊作者。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35355-6.pdf.
圖：在野生型C57BL/6小鼠聽(tīng)覺(jué)皮層快速高亮示蹤下游腦區(qū)
a. 簡(jiǎn)化的聽(tīng)皮層環(huán)路示意圖；b. 實(shí)驗(yàn)流程示意圖；c-d. 注射位點(diǎn)代表性標(biāo)記圖；e-i. 聽(tīng)皮層下游代表性標(biāo)記圖。