2022年1月，中國(guó)科學(xué)院武漢病毒研究所/國(guó)家病毒資源庫(kù)鄧菲/沈姝團(tuán)隊(duì)與英國(guó)利物浦大學(xué)蜱細(xì)胞庫(kù)合作，在Ticks and tick-borne diseases雜志發(fā)表題為“Differential characteristics of mammalian and tick-derived promoters to trigger protein expression in transfected tick cell lines” 的論文，解析了利用質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法在兩種蜱細(xì)胞系表達(dá)外源蛋白的特性，比較分析了哺乳動(dòng)物細(xì)胞系適用的商品化啟動(dòng)子和4種蜱源啟動(dòng)子在蜱細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)外源蛋白表達(dá)的效率，以及不同轉(zhuǎn)染試劑對(duì)該方法的影響。研究成果為利用蜱細(xì)胞系開(kāi)展蜱傳病毒病原學(xué)以及與蜱互作機(jī)制的研究奠定重要的技術(shù)基礎(chǔ)。

    多種與人類(lèi)和動(dòng)物疾病相關(guān)的蜱傳病毒，如蜱傳腦炎病毒（TBEV）、克里米亞-剛果出血熱病毒（CCHFV），發(fā)熱伴血小板減少綜合征病毒（SFTSV）、以及對(duì)豬高致病性的非洲豬瘟病毒（ASFV）等的流行，嚴(yán)重威脅人口健康，給畜牧產(chǎn)業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。研究蜱傳病毒的生物學(xué)特性及其在媒介蜱種中的感染復(fù)制特性，將有助于深入理解蜱傳病毒潛在的傳播感染風(fēng)險(xiǎn)，對(duì)干預(yù)病毒在蜱中進(jìn)行有效的感染復(fù)制有重要意義。為了解析蜱傳病毒在蜱中的感染復(fù)制特性以及與蜱之間的蛋白分子互作，十分有必要利用蜱類(lèi)細(xì)胞系建立體外研究模型，對(duì)開(kāi)展病毒與蜱互作的初步的探索性研究，鑒定與病毒感染復(fù)制關(guān)聯(lián)的關(guān)鍵蜱類(lèi)蛋白/因子提供必要的技術(shù)手段。

    目前，通過(guò)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染人/哺乳動(dòng)物細(xì)胞系是研究外源蛋白與宿主細(xì)胞互作中被廣泛運(yùn)用的實(shí)驗(yàn)手段，已經(jīng)形成了如巨細(xì)胞病毒（CMV）、猿猴病毒（SV40）、單純性皰疹病毒（HSV）等病毒來(lái)源的商品化啟動(dòng)子、動(dòng)物來(lái)源啟動(dòng)子如雞β-肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子（CAG），以及人來(lái)源啟動(dòng)子如人磷酸甘油酸酯激酶啟動(dòng)子（PGK）。而蜱細(xì)胞系因其種類(lèi)不多，基因組功能注釋有限，對(duì)蜱細(xì)胞系的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和外源蛋白表達(dá)的方法和效率研究還比較有限。建立針對(duì)蜱細(xì)胞系的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方法并高效驅(qū)動(dòng)外源蛋白表達(dá)，對(duì)開(kāi)展蜱傳病毒與蜱細(xì)胞關(guān)鍵蛋白和因子的互作機(jī)制研究，解析病毒在蜱細(xì)胞中的感染復(fù)制機(jī)制有重要意義。

    該研究通過(guò)分析肩突硬蜱細(xì)胞系IED8的轉(zhuǎn)錄譜，選取高表達(dá)基因上游序列作為可能的蜱來(lái)源候選啟動(dòng)子，克隆至熒光素酶報(bào)告質(zhì)粒并轉(zhuǎn)染到蜱細(xì)胞中，通過(guò)檢測(cè)細(xì)胞中熒光素酶的活性最終篩選到4個(gè)具有啟動(dòng)子活性的啟動(dòng)子（Pro3、Pro5、Pro8、Pro12）（圖1）。研究還比較分析了哺乳動(dòng)物細(xì)胞系轉(zhuǎn)染中常用的商品化啟動(dòng)子CMV、PKG和CAG在蜱細(xì)胞系IDE8（肩突硬蜱）中的效率，結(jié)果表明CAG啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)熒光蛋白表達(dá)效率顯著高于CMV、PKG啟動(dòng)子以及4個(gè)蜱細(xì)胞來(lái)源的啟動(dòng)子（圖2）；還發(fā)現(xiàn)在蜱細(xì)胞中，哺乳動(dòng)物細(xì)胞系適用的啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源蛋白表達(dá)水平在第3天達(dá)到峰值，而蜱源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)外源蛋白表達(dá)水平在轉(zhuǎn)染后的第2天達(dá)到峰值，提示哺乳動(dòng)物細(xì)胞系適用的啟動(dòng)子與蜱源啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)蛋白表達(dá)時(shí)相有明顯差異。該研究還比較分析了3種利用不同機(jī)制將外源核酸轉(zhuǎn)染進(jìn)入細(xì)胞的商品化試劑對(duì)蜱細(xì)胞系轉(zhuǎn)染質(zhì)粒表達(dá)外源蛋白效率的影響，表明一種與DNA濃縮增強(qiáng)劑聯(lián)合作用的非脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑（Effectene with Enhancer）對(duì)蜱細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率優(yōu)于其他試劑。本研究結(jié)果為利用蜱細(xì)胞系開(kāi)展蜱源蛋白功能研究，蜱細(xì)胞基因改造，解析病毒與蜱蛋白互作機(jī)制和關(guān)系等相關(guān)實(shí)驗(yàn)涉及的重要技術(shù)手段提供必要參考。

    武漢病毒所/國(guó)家病毒資源庫(kù)博士后史君明為論文第一作者，沈姝青年研究員為通訊作者。該研究得到了中國(guó)科學(xué)院生物資源能力建設(shè)項(xiàng)目（KFJ-BRP-017-74、KFJ-BRP-017-06）、國(guó)家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃（2019YFC1200701），英國(guó)生物技術(shù)與生物科學(xué)研究理事會(huì)項(xiàng)目（BB/P024270/1）的支持。

全文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.ttbdis.2022.101906

圖1  蜱來(lái)源的4個(gè)啟動(dòng)子在IDE8和IRE/CTVM19蜱細(xì)胞系中啟動(dòng)熒光素酶表達(dá)與活性檢測(cè)

圖2 蜱來(lái)源啟動(dòng)子與哺乳動(dòng)物細(xì)胞常用啟動(dòng)子在到IDE8細(xì)胞中驅(qū)動(dòng)外源蛋白表達(dá)活性比較