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2022年12月，國際學(xué)術(shù)期刊《Nature Communications》在線發(fā)表了中國科學(xué)院武漢病毒研究所羅敏華團隊的最新成果，論文題目為“An HSV-1-H129 amplicon tracer system for rapid and efficient monosynaptic anterograde neural circuit tracing”。該研究基于HSV-1 H129擴增子與H129-dTK-T2進行多輪病毒改造，研發(fā)出標記亮度高、實驗周期短（5天）、操作簡單（1次病毒注射）、標記的下游神經(jīng)元毒性低的新型順向跨單級示蹤工具系統(tǒng)H129Amp。
繪制腦神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)聯(lián)結(jié)圖譜對解析大腦結(jié)構(gòu)與功能不可或缺。神經(jīng)環(huán)路示蹤病毒工具是解析腦聯(lián)結(jié)圖譜的重要工具。羅敏華課題組首先對HSV-1 H129株進行改造，開發(fā)了攜帶2x GFP和2x mGFP的高亮度的順向跨多級示蹤工具H129-G4。H129-G4熒光強度高，可展示神經(jīng)元樹突棘等細節(jié)，為首個與fMOST聯(lián)用的順向示蹤工具。在該病毒改造平臺基礎(chǔ)上，團隊開發(fā)并首次報道了順向跨單級示蹤工具H129-dTK-tdT（Mol Neurodegener. 2017. 12:38），填補了順向跨單級示蹤工具的空白，實現(xiàn)了0到1的突破。團隊隨后研發(fā)了H129-dTK-T2，提高標記亮度，優(yōu)化了生產(chǎn)和應(yīng)用工藝 (Neurosci Bull. 2020.37:701)。為增強順向跨單級示蹤工具的標記強度和效率、縮短示蹤時間、并降低其末端吸收，該團隊靶向H129的gK基因，構(gòu)建突變gK囊膜化的順向跨單級示蹤工具H129-dgK-G4。H129-dgK-G4展示了更高標記強度和示蹤效率、更特異的順向標記特性、縮短了示蹤時間（Mol Neurodegener. 2022. 17:6）。
該團隊進一步采取全新策略，以H129-dTK-T2-pacFlox作為輔助病毒，H129擴增子作為示蹤病毒，構(gòu)建了H129Amp示蹤系統(tǒng)。示蹤病毒H129Amp含多拷貝串聯(lián)的標記基因（靶基因），可快速、高效表達靶標蛋白，標記下游神經(jīng)元；傳播到下游神經(jīng)元的H129Amp示蹤病毒，不含任何病毒毒性基因，對下游神經(jīng)元無/低毒性。除基因組不同外，輔助病毒與示蹤病毒結(jié)構(gòu)和感染特性一致，可混合后同時注射（單次），5天后可高亮標記下游神經(jīng)元，結(jié)合光遺傳學(xué)工具AAV-DIO-ChR2或H129-dgK-G4順向跨單級示蹤工具系統(tǒng)，可進行功能性研究或順向跨兩級示蹤。與傳統(tǒng)示蹤工具相比，其優(yōu)勢包括 1）該系統(tǒng)具有標記亮度高，不需要免疫染色以放大信號；2）實驗周期短， 由30天縮短至5天，大大縮短了實驗周期；3） 操作簡單和避免空間錯位，單次病毒注射替代了原來的2次序貫性（第1、21天）病毒注射，簡化了操作，避免了2次注射導(dǎo)致的空間錯位，重復(fù)性和標記效率高；4）下游神經(jīng)元無/低毒性，可進行功能研究、順向跨兩級研究等。有望進一步推動神經(jīng)科學(xué)和腦計劃。
該研究得到了國家自然科學(xué)基金（81620108021, 82172264, 32070169, 81571355, 81601206）的資助。武漢病毒所博士生熊鋒（現(xiàn)中科院精密測量科學(xué)和技術(shù)創(chuàng)新研究院博士后）和楊虹為共同第一作者，武漢病毒所羅敏華研究員、曾文波副研究員、北京腦科學(xué)與類腦研究中心載體中心主任趙非為共同通訊作者。
論文鏈接：https://www.nature.com/articles/s41467-022-35355-6.pdf.
圖：在野生型C57BL/6小鼠聽覺皮層快速高亮示蹤下游腦區(qū)
a. 簡化的聽皮層環(huán)路示意圖；b. 實驗流程示意圖；c-d. 注射位點代表性標記圖；e-i. 聽皮層下游代表性標記圖。