卵生動(dòng)物的早期胚胎發(fā)育主要依賴(lài)于卵黃囊中儲(chǔ)存的物質(zhì)，即卵黃物質(zhì)。卵黃物質(zhì)形成于卵母細(xì)胞的發(fā)育階段，因此也被稱(chēng)為母源物質(zhì)，其主要包括母源RNA、蛋白質(zhì)、脂質(zhì)等。在胚胎發(fā)育期間，母源物質(zhì)直接或者間接地被發(fā)育中的胚胎所利用。有關(guān)母源RNA或蛋白質(zhì)調(diào)控胚胎早期發(fā)育，已經(jīng)有相當(dāng)多的研究，但是母源脂質(zhì)如何被胚胎發(fā)育所有效利用并調(diào)控胚胎發(fā)育，其作用機(jī)制仍不清晰。一方面，作為卵生動(dòng)物的代表，魚(yú)類(lèi)在開(kāi)口攝食之前的胚胎發(fā)育完全依賴(lài)于母源的卵黃物質(zhì)及其代謝產(chǎn)物，是研究母源脂質(zhì)調(diào)控胚胎發(fā)育的良好模型；另一方面，在養(yǎng)殖魚(yú)類(lèi)繁育實(shí)踐中，卵黃能否被有效吸收利用，仔魚(yú)能否正常開(kāi)口攝食，實(shí)現(xiàn)胚胎從內(nèi)源營(yíng)養(yǎng)到外源營(yíng)養(yǎng)的過(guò)渡，是影響胚胎孵化率、魚(yú)苗成活率和養(yǎng)殖效益的瓶頸要素。因此，利用斑馬魚(yú)模型開(kāi)展胚胎“內(nèi)源-外源營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)換（endogenous-to-exogenous nutrient source transition,eeNST）”機(jī)制研究，有著重要的理論意義和應(yīng)用價(jià)值。

中國(guó)科學(xué)院水生生物研究所孫永華團(tuán)隊(duì)長(zhǎng)期致力于魚(yú)類(lèi)生殖細(xì)胞發(fā)育及其育種生物技術(shù)研究。在前期的研究中，該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)了母源Nanog在卵子發(fā)生過(guò)程中通過(guò)全局性翻譯控制促進(jìn)卵子發(fā)生和卵子質(zhì)量（He et al.,Development,2022）（研究進(jìn)展 | 水生所揭示母源因子Nanog通過(guò)翻譯控制促進(jìn)魚(yú)類(lèi)卵子發(fā)生和卵子質(zhì)量的新機(jī)制），在受精后通過(guò)蛋白互作調(diào)控母源β-catenin活性以確保胚胎背腹軸正常形成的新機(jī)制（He et al.,PLOS Biology,2020）（研究進(jìn)展 | 水生所在魚(yú)類(lèi)母源因子與胚胎發(fā)育和生殖細(xì)胞操作研究中取得系列重要進(jìn)展）。通過(guò)構(gòu)建二十二碳六烯酸（DHA）內(nèi)源合成缺陷的elovl2突變體（Liu et al.,Mar Biotechnol,2020）和DHA內(nèi)源合成增強(qiáng)的fat1轉(zhuǎn)基因系（Pang et al.,Mar Biotechnol,2014），初步發(fā)現(xiàn)內(nèi)源合成的DHA可以通過(guò)DHA-cyp11a1-P5軸促進(jìn)卵母細(xì)胞中微管組裝以提升卵子質(zhì)量（Li et al.,Zool Res,2024）（研究進(jìn)展 | 水生所發(fā)現(xiàn)內(nèi)源合成DHA促進(jìn)魚(yú)類(lèi)肝臟脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)和卵子質(zhì)量的新機(jī)制）。

2024年11月12日，孫永華團(tuán)隊(duì)在國(guó)際學(xué)術(shù)期刊Nature Communications上發(fā)表了題為“Intestinal DHA-PA-PG axis promotes digestive organ expansion by mediating usage of maternally-deposited yolk lipids”的研究論文。該論文利用斑馬魚(yú)模型，發(fā)現(xiàn)eeNST階段的胚胎原始腸道中存在一個(gè)“DHA-PA（磷脂酸）-PG（磷脂酰甘油）軸”，其調(diào)控了母源脂質(zhì)的吸收利用并促進(jìn)內(nèi)胚層器官的擴(kuò)張，從而協(xié)助胚胎順利完成eeNST轉(zhuǎn)換。

為研究長(zhǎng)鏈多不飽和脂肪酸（long-chain polyunsaturated fatty acids，LC-PUFAs）在卵黃脂質(zhì)吸收調(diào)控中的作用機(jī)制，研究團(tuán)隊(duì)首先分析了eeNST之前胚胎中LC-PUFAs的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)omega-3 PUFAs（n-3 PUFAs）含量伴隨著胚胎發(fā)育顯著上升，表明此時(shí)的胚胎存在著旺盛的脂質(zhì)重塑。對(duì)胚胎期的原始腸道和肝臟RNA-seq數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)參與LC-PUFA合成的hsd17b12a基因在原始腸道中高表達(dá)。隨后，他們利用近期建立的CRISPR/Cas9與iPGC誘導(dǎo)相結(jié)合的基因敲入技術(shù)（Wang et al.,Nature Communications,2023）(研究進(jìn)展 | 水生所取得魚(yú)類(lèi)誘導(dǎo)型原始生殖細(xì)胞理論和技術(shù)的突破)，構(gòu)建了myc蛋白標(biāo)簽和mCherry基因標(biāo)記的hsd17b12a基因敲入品系，發(fā)現(xiàn)Hsd17b12a在原始腸道上皮細(xì)胞中特異性表達(dá)（圖1），且脂肪酸延長(zhǎng)所需的其他酶編碼基因也在腸道上皮細(xì)胞中特異表達(dá)，這提示原始腸道具備脂肪酸延長(zhǎng)的能力。

圖1. Hsd17b12a特異表達(dá)于原始腸道上皮細(xì)胞且定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)

進(jìn)一步，他們利用CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了hsd17b12a敲除品系，發(fā)現(xiàn)hsd17b12a缺失導(dǎo)致原始腸道的LC-PUFA合成缺陷，最終引起胚胎卵黃吸收不全且魚(yú)鰾充氣障礙，全部死亡，無(wú)法順利度過(guò)eeNST轉(zhuǎn)換（圖2）。研究團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn)突變體原始腸道的結(jié)構(gòu)和功能都出現(xiàn)障礙，且其消化器官外分泌胰腺和肝臟的擴(kuò)張顯著受阻，hsd17b12a突變導(dǎo)致卵黃脂質(zhì)堆積的主要原因是卵黃脂質(zhì)向原始腸道的轉(zhuǎn)運(yùn)受阻。

圖2? hsd17b12a突變體eeNST轉(zhuǎn)換失敗

為探究消化器官發(fā)育缺陷和擴(kuò)張受阻的分子機(jī)制，研究者分離了hsd17b12a突變體和野生型（WT）的肝臟、胰腺和腸道，并開(kāi)展了單細(xì)胞RNA測(cè)序（scRNA-seq）分析，結(jié)果顯示原始腸道中的鐵死亡信號(hào)通路被顯著激活，并且hsd17b12a陽(yáng)性的腸道上皮細(xì)胞具有甘油磷脂代謝功能。通過(guò)Fer-1抑制鐵死亡信號(hào)，可以部分拯救內(nèi)胚層器官擴(kuò)張和卵黃吸收缺陷，這表明原始腸道的鐵死亡是內(nèi)胚層器官擴(kuò)張受阻的重要原因。

為了進(jìn)一步探討原始腸道脂質(zhì)代謝在消化器官擴(kuò)張缺陷及鐵死亡的作用機(jī)制，研究者對(duì)hsd17b12a突變體和WT進(jìn)行了脂質(zhì)組學(xué)分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)原始腸道中存在一條DHA-PA-PG代謝軸。通過(guò)一系列拯救實(shí)驗(yàn)，研究者發(fā)現(xiàn)DHA-PA-PG軸受損是腸道鐵死亡和消化器官擴(kuò)張受阻的重要原因。該研究揭示了胚胎原始腸道中DHA-PA-PG軸調(diào)控母源脂質(zhì)利用和消化器官擴(kuò)張的新機(jī)制，hsd17b12a突變導(dǎo)致DHA-PA-PG軸受損和胚胎內(nèi)源-外源營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)換（eeNST）失敗（圖3）。

圖3? DHA-PA-PG軸調(diào)控母源脂質(zhì)利用和內(nèi)源-外源營(yíng)養(yǎng)轉(zhuǎn)換的作用示意

以上論文，水生所陳正芳博士為第一作者，孫永華研究員為通訊作者，何牡丹副研究員、王厚鵬實(shí)驗(yàn)師、博士生李雪徽等共同參與了此項(xiàng)研究，單細(xì)胞測(cè)序分析和脂質(zhì)組分析分別得到上海海洋大學(xué)胡鵬教授和中國(guó)科學(xué)院遺傳與發(fā)育生物學(xué)研究所稅光厚研究員的協(xié)助。該項(xiàng)研究得到了國(guó)家杰出青年科學(xué)基金、中國(guó)科學(xué)院戰(zhàn)略性先導(dǎo)專(zhuān)項(xiàng)等資助。文中構(gòu)建的斑馬魚(yú)品系已保藏至國(guó)家水生生物種質(zhì)資源庫(kù)國(guó)家斑馬魚(yú)資源中心。

參考文獻(xiàn)：

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He,M.,Jiao,S.,Zhang,R.,Ye,D.,Wang,H.,and Sun,Y. (2022). Translational control by maternal Nanog promotes oogenesis and early embryonic development. Development 149. 10.1242/dev.201213.

Li,Y.,Li,X.,Ye,D.,Zhang,R.,Liu,C.,He,M.,Wang,H.,Hu,W.,and Sun,Y. (2024). Endogenous biosynthesis of docosahexaenoic acid (DHA) regulates fish oocyte maturation by promoting pregnenolone production.ZOOLOGICALRESEARCH 45,176-188. 10.24272/j.issn.2095-8137.2023.032.

Liu,C.,Ye,D.,Wang,H.,He,M.,and Sun,Y. (2020). Elovl2 But Not Elovl5 Is Essential for the Biosynthesis of Docosahexaenoic Acid (DHA) in Zebrafish: Insight from a Comparative Gene Knockout Study. Mar Biotechnol (NY) 22,613-619. 10.1007/s10126-020-09992-1.

Pang,S.C.,Wang,H.P.,Li,K.Y.,Zhu,Z.Y.,Kang,J.X.,and Sun,Y.H. (2014). Double Transgenesis of Humanized fat1 and fat2 Genes Promotes Omega-3 Polyunsaturated Fatty Acids Synthesis in a Zebrafish Model. Mar Biotechnol (NY) 16,580-593. 10.1007/s10126-014-9577-9.

論文鏈接：https://doi.org/10.1038/s41467-024-54258-2